Dieses Studienbuch führt auf einfache und verständliche Weise in die Grundlagen gentechnischer Arbeitsmethoden ein. Der erste Teil beinhaltet in Grundzügen die Prinzipien der Genetik und Molekularbiologie. Darauf aufbauend werden im zweiten Teil einzelne genechnische Arbeitsmethoden und ihre Anwendungsbereiche vorgestellt. Besonderes Gewicht wird auf eine leicht verständliche Sprache gelegt, die gemeinsam mit den anschaulichen Abbildungen zum Verständnis des umfangreichen Themenkomplexes beiträgt. Damit schlägt dieses Einsteigerlehrbuch eine Brücke zwischen Theorie und Praxis der Biotechnologie.
Inhaltsverzeichnis
Teil I
Grundlagen der Molekularbiologie 9
1 Aufbau und Eigenschaften von Nukleinsäuren 10
1 1 Nukleotide als Bausteine von Nukleinsäuren 10
1 2 Bestandteile und Struktur der DNA 12
1 3 Verpackung der DNA in Chromosomen 15
1 4 Bestandteile, Struktur und Formen der RNA 17
2 Prinzipien der Informationsweitergabe 18
2 1 Zellzyklus und Ablauf der Mitose 18
2 2 Replikation der DNA 20
2 3 Replikationsfehler und ihre Korrektur 23
3 Vom Gen zum Merkmal: Die Genexpression 24
3 1 Transkription 24
3 1 1 mRNA-Reifung bei Eukaryonten 26
3 2 Der genetische Code 27
3 3 Translation 29
3 4 Modifikation und Transport der neusynthetisierten Proteine 33
3 5 Regulation der Genexpression 34
Teil II
Gentechnische Methoden und ihre Anwendung 37
4 Das Enzymrepertoire der Gentechnik 38
4 1 Nukleasen 38
4 2 Restriktionsendonukleasen 40
4 3 Ligasen 44
4 4 Polymerasen 46
5 Methoden zur Isolierung von Nukleinsäuren 50
5 1 Isolierung von genomischer DNA 50
5 2 Isolierung von Plasmid- und Phagen-DNA 53
5 3 Isolierung von RNA und mRNA 55
5 4 Reverse Transkription (cDNA-Synthese) 58
5 5 Bestimmung der Nukleinsäure-Konzentration 60
6 Gelelektrophoresen 62
6 1 Trägerstoffe für Gelelektrophoresen 64
6 1 1 Agarosegele 64
6 1 2 Polyacrylamidgele 65
6 2 Nachweis der Nukleinsäuren in einem Gel 65
6 3 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Gelen 66
6 4 Gelelektrophoretische Auftrennung von RNA 68
7 Prinzipien und Methoden der DNA-Klonierung 70
7 1 Vektoren: Vehikel für den Gentransfer 71
7 1 1 Plasmide 71
7 1 2 Bakteriophagen 74
7 1 3 Cosmide und YACs 77
7 2 Durchführung einer Klonierung mit einem Plasmidvektor 79
7 2 1 Herstellung rekombinanter DNA 80
7 2 2 Erzeugung kompetenter Bakterienzellen 81
7 2 3 Transformation von E -coli-Zellen mit einem rekombinanten Plasmid 82
7 2 4 Selektion rekombinanter Bakterienzellen 82
7 2 5 Vermehrung des gewünschten Klons und Isolierung rekombinanter Plasmid-DNA 85
7 3 Herstellung von DNA-Banken 85
Zusammenfassung DNA-Klonierung 89
8 PCR: Vermehrung von DNA ohne Klonierung 90
8 1 Grundprinzipien der PCR 90
8 2 Anwendungen der PCR 97
8 2 1 PCR mit degenerierten Primern 97
8 2 2 RT-PCR 99
8 2 3 Quantitative Real-time PCR 101
8 2 4 Herstellung genetischer Fingerabdrücke 105
9 Sequenzierung von DNA 108
9 1 Methoden zur DNA-Sequenzierung 108
9 1 1 Sanger-Coulson-Methode (Kettenabbruchmethode) 108
9 1 2 Maxam-Gilbert-Methode 110
9 2 Markierung und Detektion der im Kettenabbruchverfahren entstandenen Fragmente 112
9 2 1 Radioaktive Markierung und Detektion über Autoradiographie 113
9 2 2 Nichtradioaktive Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen und Detektion mittels Laser 114
10 Blotting und Hybridisieren 116
10 1 Methoden des Blottings 116
10 1 1 Southern Blot 117
10 1 2 Northern Blot 119
10 1 3 Screening von cDNA- und genomischen Genbanken 120
10 2 Herstellung der Sonden, Markierung von DNA 121
10 2 1 Markierung der Sonden über Nick-Translation 122
10 2 2 Markierung der Sonden über Oligolabelling oder PCR 122
10 3 Hybridisieren und Detektion 123
10 3 1 Nachweis der gebundenen Sonde über Autoradiographie 124
10 3 2 Immunologischer Nachweis nicht-radioaktiv markierter Sonden 124
Zusammenfassung Blotting, Hybridisieren und Detektion 125
11 Analyse der Genexpression mit Hilfe von Microarrays (Gen-Chips) 128
Literatur 132
Bildquellen 133
Glossar und Abkürzungsverzeichnis 134
Stichwortverzeichnis 140